La imagen de la Virgen fue tallada por San Lucas, el autor de uno de los Evangelios,
aunque la imagen que hoy se venera en este lugar es una talla románica, en cedro, del siglo XII
Cuentan, que muerto el evangelista, en Acaya (Asia Menor), la imagen fue enterrada con él.
En el siglo IV, fue trasladada, con el difunto, a Constatinopla y, desde aquí, fue llevada a Roma por el cardenal Gregorio,582, legado del papa Pelagio II.
Una vez elegido pontífice, Gregorio Magno, 590, la expuso en su oratorio.
Se convierte este papa en el principal devoto de la imagen y el primer artífice de la expansión de la misma en Roma.
La virgen se anota su primera intervención milagrosa cuando el pueblo de Roma, tras aclamarla con fervor a su paso en procesión por las calles de aquella ciudad azotada por la peste, comprobó que la fatal epidemia desaparecía mientras aparecía un ángel sobre el castillo limpiando la sangre de una espada, al tiempo que un coro de ángeles cantaba:
Reina del cielo, alégrate,
alleluia,
Regina coeli, laetare,
alleluia,
que obtuvo conmovida respuesta del pontífice, Gregorio, que presidía la procesión:
Ruega al Señor por nosotros
alleluia.
Ora pro nobis deum,
alleluia
El castillo, desde entonces, tomó el nombre de Castillo Sant Angelo, refugio de papas en la paz y durante la guerra.
Isidoro, hermano del papa traslado la imagen a Sevilla y la entregó a San Leandro, arzobispo de la ciudad.
Durante la travesía, se calmó una fuerte borrasca y la imagen llegó indemne al puerto fluvial hispalense, desde allí fue trasladada a la iglesia principal, en la que fue venerada hasta la invasión musulmana del año 711.
En el año 714, unos clérigos de Sevilla, que huían del peligro sarraceno, llevaron la imagen hasta Extremadura y la escondieron junto al río Guadalupe, que significa "río escondido" (como el flujo vital de alguna "Lupe" o "Lupita") que recorre el valle al sur de la sierra de Altamira, no lejos de las Villuercas.
Hermosos paisajes que tuvimos la ocasión de contemplar en un bello atardecer, según abandonábamos y nos alejábamos de la Puebla. Durante seis siglos estuvo perdido el culto a esta imagen, hasta que los prodigios estallaron de nuevo en el siglo XIII, poco después de la recristianización de aquellos territorios.
Un humilde pastor o vaquero, vecino de Cáceres, que en el siglo XVI fue nominado Gil de Santa María (mucha hidalguía por aquel entonces) y más tarde, en el siglo XVIII, Gil Cordero (muy apropiado para Extremadura), encontró a una de sus vacas muerta. Cuando se disponía a recuperar su piel, y comenzaba a practicarle unas incisiones en forma de cruz con el cuchillo, la vaca resucitó y, en ese preciso instante, se apareció la Virgen María que le hablaba con celestial sonido:
"No temas que soy la Madre de Dios, salvador de linaje humano;
toma tu vaca y llévala al hato con las otras, y vete luego para tu tierra,
y dirás a los clérigos lo que has visto y decirles has de mi parte
que te envío yo para allá, y que vengan a este lugar donde estás
ahora, y que caven donde estaba tu vaca muerta,
Debajo de esas piedras; y hallarán ende una imagen mía.
Y cuando la sacaren, diles que no la muden ni lleven
de este lugar donde ahora está; mas que hagan una casilla
en la que la pongan.
Ca tiempo vendrá en que en este lugar se haga una iglesia
y una casa muy notable y pueblo asaz grande.
Tras estas palabras, la Virgen desapareció y el pastor marchó hacia Cáceres para avisar al clero.
Cuando llegó a su casa, un hijo acababa de fallecer. Invocó a la Virgen y el hijo resucitó. Este prodigio convenció a los clérigos sobre la verdad de la aparición y todos se dirigieron al lugar del milagroso suceso, excavaron entre las rocas y hallaron la imagen y una serie de documentos que atestiguaban su procedencia.
En el lugar del hallazgo se construyó una ermita, el pastor y su familia se quedaron al lado de la Virgen como servidores de la Madre de Dios, siendo así los primeros habitantes de La Puebla de Guadalupe.
Pronto su fama de milagrosa atraería a muchos visitantes, en el bajo claustro mudéjar hay cuadros con muchos de los milagros atribuidos a la Virgen.
Posteriormente Alfonxo XI elevó la pequeña iglesia a Santuario Nacional.
En 1389 el monasterio fue confiado a la Orden de los Jerónimos.
Actualmente lo regentan los Franciscanos.